原理:

熒光探針法通過使用能夠穿透細(xì)胞膜的熒光探針來實(shí)現(xiàn)ROS檢測。以DCFH-DA為例，該物質(zhì)本身呈非極性，可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酯酶會(huì)將DCFH-DA水解，脫去乙酰基生成DCFH。由于DCFH具有極性，無法自由跨膜，因而只能留在細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在ROS時(shí)，DCFH會(huì)被ROS氧化，生成具有強(qiáng)熒光特性的DCF。DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS的水平呈正相關(guān)，通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度，可以間接反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。

操作流程：

1. 樣本準(zhǔn)備：對于細(xì)胞樣本，需在適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期；對于組織樣本，則需先將組織剪碎，進(jìn)行勻漿處理，隨后通過離心去除雜質(zhì)，取上清液備用。

2. 探針負(fù)載：將 DCFH-DA 探針用適宜的緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，加入至細(xì)胞懸液或組織樣本中，置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 20-30 分鐘，以確保探針充分進(jìn)入細(xì)胞并被水解。

3. 清洗樣本：使用緩沖液多次洗滌細(xì)胞或樣本，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的 DCFH-DA 探針，防止其對后續(xù)檢測造成干擾。

4. 檢測熒光：將處理完畢的樣本置于熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況，或利用流式細(xì)胞儀測定樣本的熒光強(qiáng)度。若采用熒光顯微鏡，可通過拍照記錄不同視野下細(xì)胞的熒光圖像；若使用流式細(xì)胞儀，則需先對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，設(shè)定適宜的檢測參數(shù)，如激發(fā)光波長、發(fā)射光波長等，隨后將樣本上機(jī)檢測。

優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：

1. 靈敏度高，能夠精準(zhǔn)檢測細(xì)胞內(nèi)低水平的 ROS 變化。

2. 特異性顯著，通過選擇不同的熒光探針，可精確檢測特定種類的 ROS。

3. 具備細(xì)胞水平定位檢測功能，直觀展現(xiàn) ROS 在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。

4. 廣泛適用于多種樣本類型，涵蓋細(xì)胞、組織、微生物等。

缺點(diǎn)：

1. 熒光探針價(jià)格相對昂貴，顯著增加實(shí)驗(yàn)成本。

2. 熒光信號(hào)易受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)干擾，例如細(xì)胞內(nèi)的還原劑可能還原 DCF，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

3. 探針穩(wěn)定性不足，需避光保存且現(xiàn)用現(xiàn)配，對實(shí)驗(yàn)操作要求較高。